第一節(jié) 產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

一般自然無法產(chǎn)生單克隆抗體，因為自然界的抗原物質(zhì)通常都同時刺激不同抗原一起生成。只有人工才能取得針對某一特定抗原表位的單克隆抗體。單克隆的制作思路是取得某特異性的B細胞，因為特異的B細胞對應(yīng)某種特異的抗體，如果能夠純化培養(yǎng)這一種B細胞，則就可以通過刺激它生成單一種類的抗體，即單克隆抗體。通常的做法是將壽命短的漿細胞迅速與骨髓瘤細胞相融合，以克服其難培養(yǎng)壽命短的弱點，然后經(jīng)過一系列的增殖，加以刺激就可以得到單一種類的抗體，這就是單克隆抗體的做法。

目前單克隆抗體藥物還存在著許多問題有待解決。目前 研究 的一個重要方面是增加抗體的靶向性。

1、靶抗原的上調(diào)

上調(diào)遞呈抗原的量也能增加靶/非靶比，增加抗原表達的水平可改善基于該抗原的診斷和治療。例如，高熱可以增加腫瘤中遞呈抗原的量，幾種細胞因子如INF-γ、INF-α和IL-6都有上調(diào)細胞表面抗原如組織相容性抗原和腫瘤相關(guān)抗原的作用。體內(nèi)外 研究 均顯示應(yīng)用這些細胞因子后抗體攝取增加。聯(lián)合使用細胞因子使抗原的表達進一步增加，表明一些細胞因子具有協(xié)同作用。

2、生物素-親和素預(yù)定位技術(shù)

近10年來， 研究 較多的是預(yù)定位技術(shù)，該方法將放射性核素與抗體分開給藥，核素并不標(biāo)記抗體本身，當(dāng)生物素化抗體預(yù)定位于腫瘤組織內(nèi)達高峰時，再注入核素標(biāo)記的親和素或先注入親和素化抗體，再注入核素標(biāo)記的生物素?？稍黾幽[瘤的攝取，加速血清除，提高T/NT比值和縮短顯像時間。

3、增加腫瘤的血流和通透性

應(yīng)用普奈洛爾、血管緊張素等血管活性藥物，增加腫瘤組織的血流量，提高標(biāo)記抗體進入腫瘤組織的量。還可應(yīng)用小劑量外照射、局部加熱、注射IL-2以及TNF等，增加腫瘤血管的通透性，使標(biāo)記抗體易于通過血管壁進入腫瘤組織。

此外，單克隆抗體靶向治療仍需在以下方面做進一步的 研究 :

1、腫瘤攝取率

靜脈注射標(biāo)記抗體，腫瘤的實際攝取率較低(<0.001～0.05%)，除抗體的特異性外，抗原密度，局部血流量，壞死程度和間質(zhì)等都是影響因素，在治療中應(yīng)用親和素-生物素預(yù)定位技術(shù)可加速血清除，減少本底從而增加腫瘤攝取以提高療效。改變給藥途徑也是一種方法，如間質(zhì)注射，介入動脈給藥，腔內(nèi)注射等。

2、HAMA反應(yīng)

多次重復(fù)使用鼠源性抗體會產(chǎn)生HAMA反應(yīng)，還會改變生物學(xué)分布從而影響診斷和治療效果。治療時往往需要多次注射抗體，且抗體的用量也大更易誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)的產(chǎn)生，因此可望利用基因工程技術(shù)制備出符合治療用的人源性抗體，降低免疫原性，減少或無HAMA反應(yīng)。相應(yīng)隨著基因工程技術(shù)的進一步發(fā)展，必將為單克隆抗體靶向治療帶來更大的發(fā)展。

第二節(jié) 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝特點或流程

（一）普通單克隆抗體的制備方法如下：

1、動物的選擇與免疫

1）動物的選擇

純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。

2）免疫方案

選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml，0.2ml/點）。

↓3周后，第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）。

↓3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價）。

↓2～3周，加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）。

↓3天后，取脾融合。

目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，增強免疫細胞對抗原的反應(yīng)性。

（2）顆?？乖庖咝詮?，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。

初次免疫1×107/0.5mlip。

↓2～3周后，第二次免疫1×107/0.5mlip。

↓3周后，加強免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip或iv。

↓取脾融合。

2、細胞融合

1）細胞融合前準(zhǔn)備

（1）骨髓瘤細胞系的選擇：

骨髓瘤細胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。

常用的骨髓瘤細胞系

骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

（2）飼養(yǎng)細胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。

2）細胞融合的步驟

（1）制備飼養(yǎng)細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周。

↓拉頸處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min。

↓用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜。

↓用無菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴禁刺破腸管）。

↓反復(fù)沖洗，吸出沖洗液。

↓沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min。

↓用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)至1×105/ml。

↓加入96孔板，100μl/孔。

↓放入37℃CO2孵箱培養(yǎng)。

（2）制備免疫脾細胞

最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死。

↓無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次。

↓脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)。

↓離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次。

↓計數(shù)。

↓取108脾淋巴細胞懸液備用。

（3）制備骨髓瘤細胞

取對數(shù)生長骨髓瘤細胞離心。

↓用無血清培養(yǎng)液洗2次。

↓計數(shù)，取得×107細胞備用。

（4）融合

①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm，8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。

②90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

③加37℃預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④離心，800rpm，6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。

⑥將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

⑦將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3、選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

1）HAT選擇雜交瘤細胞

脾細胞和骨髓瘤細胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。

在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。

2）抗體的檢測

檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。

4、雜交瘤的克隆化

雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關(guān)抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

1）有限稀釋法克隆

（1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。

（2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。

（3）調(diào)整細胞為3～10個細胞/ml。

（4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

（6）8～9天可見細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。

（8）每個克隆應(yīng)盡快凍存。

2）軟瓊脂培養(yǎng)法克隆

（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

（4）1ml0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

（5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

（6）4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔中進行培養(yǎng)。

（7）檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。

5、雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇

1）雜交瘤細胞的凍存

及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。

凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復(fù)蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。

2）細胞復(fù)蘇方法

將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞形成集落時，檢測抗體活性。

6、單克隆抗體的大量生產(chǎn)

大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。

2）體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

（1）實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml，共2～4點。待腫瘤達到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

（2）腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。

7、單克隆抗體的鑒定

對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個方面的鑒定：

1）抗體特異性的鑒定

除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

2）McAb的Ig類與亞類的鑒定

一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進行篩選時已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。

3）McAb中和活性的鑒定

用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

4）McAb識別抗原表位的鑒定

用競爭結(jié)合試驗，測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

5）McAb親合力的鑒定

用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。

（二）制備人單抗的途徑

目前，制備人單抗的途徑主要有以下5種：

1、人-鼠雜交瘤技術(shù)；

2、人-人雜交瘤技術(shù)；

3、EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)；

4、EB病毒轉(zhuǎn)化-雜交瘤技術(shù)；

5、DNA重組技術(shù)。

人源單抗的制備具有建株困難、Ig產(chǎn)量低、穩(wěn)定性和親和力差等難點，且一直缺乏有效的解決辦法。近年來基因工程技術(shù)的發(fā)展，為鼠一人嵌合單抗的制備開創(chuàng)了新的途徑。利用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)建立分體特異性單抗雜交瘤細胞系，從中提取已重排的編碼功能性IgDNA基因組（組建DNA文庫）或成熟的IgH/L鏈mRNA片段（組建cDNA文庫及制備探針），從而獲得編碼特異性單機的V區(qū)基因；利用DNA重組技術(shù)，將此來源于小鼠特異性IgH、L鏈的C區(qū)基因組重組，構(gòu)建鼠-人嵌合的Ig重組基因；然后將此重組嵌合的Ig基因?qū)胝婧吮磉_質(zhì)粒（多為pSVZ－ypt和pSVZ－neo）；經(jīng)磷酸鈣沉淀技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)或電穿孔導(dǎo)人技術(shù)，將此贗位轉(zhuǎn)染哺乳動物非分泌型骨髓瘤細胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，從中篩選分泌完鱉功能性鼠-人嵌合單抗。此單抗臨床用于人體內(nèi)診斷和治療時，不但具有原鼠源單抗的特異性、親和力和細胞毒性，同時還有優(yōu)于鼠源單抗的介導(dǎo)補體，細胞對靶抗原的殺傷作用，而且不會引起過敏反應(yīng)或干擾治療效果。從而為臨床體內(nèi)診斷、治療惡性腫瘤和病毒性疾病提供了一種新型的免疫治療制劑。

現(xiàn)DNA重組鼠一人嵌合單抗已有下列4種：

（1）小鼠F（ab）2-人FC段的嵌合抗體；（2）小鼠-人嵌合的Fab抗體；（3）小鼠-人嵌合單抗Fab片段-酶的重組抗體；（4）鼠抗體超變區(qū)（CDR）植入人單抗的嵌合體，即在人單抗可變區(qū)H、L鏈上分別植入3-4條鼠抗體的CDR區(qū)帶。

由于鼠-人嵌合單抗中鼠抗體蛋白成分減少，從而增加了臨床反復(fù)使用單抗治療的可能性。

第三節(jié) 國內(nèi)外生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展趨勢 分析

治療性單克隆抗體的快速發(fā)展在人類以腫瘤為主的多種疾病的治療方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。為了降低鼠源抗體引起的超敏反應(yīng)，治療性單克隆抗體已由改型抗體，人源化抗體發(fā)展到全人抗體。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，相信人源化單克隆抗體的前景會越來越廣泛。

近年來，隨著Symphoge公司的Symplex和Sympress等技術(shù)的發(fā)展，以及由此而生產(chǎn)、用于治療原發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）和新生兒溶血癥（HDN）的多克隆抗體藥物Sym001(anti-RhD)進入Ⅱ期臨床試驗，重組多克隆抗體藥物 研究 也呈現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢。

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