第一節(jié) 基本生產(chǎn)技術(shù)、工藝或流程

1985年具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)的發(fā)明,標(biāo)志著NAT的誕生。隨后,在PCR的基礎(chǔ)上,派生出許多其它原理的體外NAT方法。這些技術(shù)靈敏度和特異性或高或低,操作或簡單或復(fù)雜,適合在各自不同的領(lǐng)域運用，目前適用于大樣本量血液篩查并能滿足高靈敏度要求的擴證擴增技術(shù)主要為PCR技術(shù)和TMA技術(shù)。

1、PCR擴增方法

PCR是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù),以其高敏感性、高特異性和快速簡便等優(yōu)勢得到了廣泛的應(yīng)用。通過簡單的技術(shù)改進(jìn)和聯(lián)合,涌現(xiàn)出了各種各樣不同的PCR方法,如檢測RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT PCR)、敏感性和特異性均較高的巢式PCR (nested PCR)、可對靶序列進(jìn)行定量檢測的定量PCR、檢測基因超長分布的多重PCR以及PCR結(jié)合酶標(biāo)技術(shù)(PCR ELISA)、PCR結(jié)合寡核酸探針雜交技術(shù)(PCR SSOP)、熒光PCR和免疫PCR等。

目前在臨床檢測中使用較多的是熒光定量PCR,主要用于各種傳染病的診斷、病毒滴度監(jiān)測以及療效評估,因采用熒光標(biāo)記的探針雜交或直接使用能和雙鏈DNA結(jié)合的熒光素檢測PCR擴增產(chǎn)物,進(jìn)一步提高了檢測的敏感性和特異性。若加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)或外標(biāo),便能進(jìn)行定量檢測。由于該方法實現(xiàn)了反應(yīng)體系的全封閉和操作的全自動,不僅減少了污染,還提高了效率。

雖然國內(nèi)許多生物技術(shù)企業(yè)已經(jīng)利用熒光PCR方法開發(fā)出成熟的NAT定量檢測產(chǎn)品,如深圳匹基、廣州達(dá)安、上海復(fù)星、上海科華、上海浩源等,但這些產(chǎn)品均只獲得我國食品和藥品監(jiān)督部門的臨床診斷使用許可證。而臨床診斷和血液篩檢是2個不同的應(yīng)用領(lǐng)域, 血液篩檢對試劑的要求要比臨床診斷高很多。迄今為止正式通過美國FDA認(rèn)證可用于血液篩檢的試劑僅有2種,即Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV和 HIV 1/HCV檢測系統(tǒng),FDA評判這些試劑是否能用于血液篩檢的標(biāo)準(zhǔn)之一: 必須對50copies/ml的病毒核酸的檢出率>95%。相當(dāng)一部分國產(chǎn)熒光定量PCR檢測試劑或許能在某些標(biāo)本上獲得20copies/ml的靈敏度,但一般都很難滿足95%檢出低病毒載量標(biāo)本的要求。相信不斷提高檢測靈敏度,早日研發(fā)并注冊成功我國自己的NAT血液篩檢用試劑也是國內(nèi)生物技術(shù)企業(yè)的發(fā)展目標(biāo)。

2、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增方法 

包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增系統(tǒng)(transcription mediated amplification,TMA)和核酸序列依賴擴增系統(tǒng)(nucleic acidｓsequence based amplification,　NASBA)。TMA是一種利用Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA多聚酶2種酶的共同作用,在等溫條件下來擴增RNA或DNA的反應(yīng)系統(tǒng),主要擴增原理為: 目標(biāo)序列在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,以引物為引導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后,合成雙鏈的DNA,并在T7 RNA多聚酶作用下,轉(zhuǎn)錄出成千上萬個目標(biāo)RNA序列,這些RNA又可以作為模板進(jìn)行下一個循環(huán),整個反應(yīng)是一個自催化過程。NASBA的原理與TMA相似,只是在核酸提取和擴增產(chǎn)物檢測的方法上有所不同。這兩種方法的特異性強,靈敏度高,反應(yīng)條件簡單,擴增效率高,無需專門的擴增儀器,且因整個反應(yīng)在1個試管中進(jìn)行,也減少了污染。

3、其它NAT技術(shù)

包括支鏈DNA檢測技術(shù)(branched DNA signal amplification assay,bDNA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、連接酶鏈技術(shù)(ligase chain reaction, LCR)和鏈置換擴增(strand displacement amplification,SDA)等。這些技術(shù)或因為自身原因,或因為剛研發(fā)出來尚未進(jìn)入臨床,均未在血液篩檢中應(yīng)用。如bDNA技術(shù)，在1995年左右推出,其信號放大是通過堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的探針雜交結(jié)合到一個樹枝狀核酸枝狀體上而實現(xiàn)的。bDNA技術(shù)對待測DNA無擴增,特異性較好,能進(jìn)行病毒定量檢測,動態(tài)地揭示病毒滴度水平的變化,不僅在預(yù)測干擾素療效方面可為臨床提供更為有用的信息,還可作為丙肝病人對干擾素完全應(yīng)答的標(biāo)志反應(yīng)。但也正因為bDNA技術(shù)沒有擴增待測核酸,其檢測靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCR,故該項技術(shù)實際上不適合用于血液篩檢,目前國內(nèi)主要將bDNA技術(shù)用于HBV或HCV病毒滴度的定量 分析 。

第二節(jié) 新技術(shù)研發(fā)、應(yīng)用情況

我國有關(guān)NAT血液篩檢 研究 的報道還比較少見。比較規(guī)范的血液篩檢 研究 更少，有的單位利用國產(chǎn)PCR試劑加電泳檢測的方法進(jìn)行檢測，其實驗室交叉污染的問題很難控制。

國內(nèi)血液中心開展NAT檢測 研究 的情況

國內(nèi)原料漿開展NAT檢測 研究 情況

第三節(jié) 國外技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

NAT是一種新興的檢測方法,許多國家及輸血機構(gòu)都進(jìn)行了一系列的 研究 ,在國外特別是一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已普遍應(yīng)用于血液篩檢[12]，例如,日本是世界上最早在全國范圍內(nèi)對血液進(jìn)行HBV、HCV、HIV NAT篩檢的國家[13],新加坡、中國香港也已經(jīng)分別采用不同的方式對血液進(jìn)行NAT篩檢; 德國和荷蘭從1997年起就開始NAT篩檢的嘗試,英國和法國的部分血站也從2000年起開始了NAT血液篩檢; 美國則從1999年3月開始在FDA新藥審核程序下使用不同的試劑進(jìn)行常規(guī)血液篩檢。

日本使用的方法為羅氏公司與日本紅十字會共同開發(fā)的全自動的Ampli NATＴＭ NPX系統(tǒng)（為熒光PCR技術(shù)，可同時聯(lián)合檢測HBV,HCV和HIV），目前正在考慮使用Chiron公司的TMA技術(shù);美國ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技術(shù);美國血液中心(ABC)系統(tǒng)則使用羅氏COBAS Ampli Screen; 荷蘭及部分歐洲國家將荷蘭阿克蘇公司推出的 

Nucliesens全自動核酸提取方法同羅氏的COBAS Ampli Screen擴增體系結(jié)合起來使用;而英國和法國的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自動核酸提取系統(tǒng)與羅氏的COBAS Ampli Screen擴增體系結(jié)合起來的方法, 隨后部分血站又更換成Chiron的TMA技術(shù)。各血站根據(jù)自身特色, 正在對各種不同的技術(shù)組合進(jìn)行評估, 目的是尋求一種最適合的NAT技術(shù),既保障血液安全,又能保證血液的及時供給,還要做到省時省力。

第四節(jié) 技術(shù)開發(fā)熱點、難點 分析

核酸擴增技術(shù)以其敏感、特異、快速、簡便向人們充分展示了其在結(jié)核病臨床診斷中的巨大優(yōu)越性。Amplicor PCR和AMTDT已在國外臨床微生物學(xué)實驗室普遍開展應(yīng)用，并取得了令人滿意的效果。由PCR衍生的幾種新的分子診斷技術(shù)(LCR、SDA、QB復(fù)制酶擴增法等)正逐步由實驗室過渡到臨床。核酸擴增技術(shù)是一種新興的發(fā)展中的診斷技術(shù)，在不少方面仍有待改進(jìn)與完善，如方法學(xué)上進(jìn)一步自動化、簡單化，優(yōu)化實驗條件與參數(shù)，不斷改進(jìn)檢測手段，拓寬應(yīng)用范圍(分支桿菌菌型鑒定、藥敏試驗、化療效果的監(jiān)測等)，開發(fā)更為實用的標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒等。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，相信該技術(shù)不久將成為診斷結(jié)核病的常規(guī)方法。

第五節(jié) 技術(shù)未來發(fā)展趨勢 分析

最近幾年,NAT血液檢測篩選系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于全球范圍內(nèi)血庫及輸血中心的血液樣本中的病毒檢測。許多國家（地區(qū)）現(xiàn)在僅使用經(jīng)NAT測試顯示HCV RNA為陰性的血液用于病人輸血。在另一些國家（地區(qū)）,還要求針對其它病毒的測試(即HIV, HBV, parvovirus B19,HAV)。當(dāng)前的NAT測試系統(tǒng)通常用于測試來自16~96位供血者的集體血樣。當(dāng)前,機構(gòu)內(nèi)部自我改進(jìn)的NAT系統(tǒng)被廣泛使用,因為它們具有比商業(yè)系統(tǒng)更了不起的敏感性、靈活性、高通量及低成本。結(jié)合自動化的核酸提取系統(tǒng),譬如NucliSens 或BioRobot, 結(jié)合自動化的擴增及檢測系統(tǒng),譬如COBAS Amplicor, AmpliScreen 或TaqMan 檢驗,數(shù)個國家（地區(qū)）血液服務(wù)中心開發(fā)了完全自動化的NAT系統(tǒng)。隨著NAT 技術(shù)進(jìn)展，在將來有可能實現(xiàn)由集體血樣NAT向單個血樣NAT的轉(zhuǎn)變，以及整合多種病毒或包括寄生蟲和細(xì)菌的其它病原體的檢測?；蛟S更為重要的意義在于,利用已有的NAT技術(shù)定期進(jìn)行血庫審查，可以迅速引入對將來可能出現(xiàn)的新型病原體的篩選檢測，從而防止類似二十年前發(fā)生的由輸血導(dǎo)致的HIV傳染。


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